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Oragene FAQs
採取
- Q：DNA収量はどのくらいですか
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A：208サンプルによる実験より唾液2mlから得られるDNA収量の中央値は110µg、平均値は100µgでした。そのうち25%は62µg、75%は158µgのDNA収量を得ることができました。収量の範囲は10～375µgまで及びました。（参考データPDF）
- Q：報告されているDNA収量にRNAは含まれませんか
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A：110µgと言う値は蛍光色素により測定した方法なのでRNAは含まれていません。吸光度計による測定方ではRNase処理されていない限りDNA+RNAの値が測定されます。RNAはDNAと同量含まれていると考えられるので2mlの唾液サンプルより約200µgの核酸（DNA+RNA）が含まれていると推測されます。
- Q：DNA収量を測定する推奨方法はありますか
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A：二重螺旋構造であるDNAに結合するSYBR GreenやPico Green(分子プローブ)などの蛍光色素を用いた測量を推奨します。吸光度計による測量はDNAとともに精製されてしまうRNA量も測量してしまい、DNA収量を過大に定量してしまう可能性があります。吸光度計による測量は相対的に見ると精度は低いですがPCRやその他のアプリケーションに対しては十分問題のない精度の測量です。（参考データPDF）
- Q：実際に得られたDNA収量は報告されている中央値110µgよりも低い値になってしまいましたがこれはなぜですか
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A：唾液中のDNA量は大きく変動します。同じ検体からも日によって唾液より得られるDNA量は変動します。
- Q：DNA収量を増やすためにはどうすれば良いですか
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A：DNA収量は唾液採取量に比例します。検体からできるだけ多くの唾液を採取してください。通常Orageneは2mlの唾液を採取することになっていますが、Orageneは4mlの唾液まで保存する能力があります。（参考データPDF）
- Q：唾液が2ml採取できなくてもOrageneは使用できますか
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A：Oragene溶液は数ulから4mlまでの様々な量の唾液を保存することができます。（参考データPDF）
- Q：唾液中のDNA源は何ですか
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A：DNA源は口腔内細胞及び白血球細胞です。唾液中の半数以上が白血球細胞と報告されているので唾液2mlより100µgのDNAが得られるとすれば50～80µgのDNAは白血球由来と考えられます。
- Q：唾液を吐くことができない乳児や幼児の唾液はどうやって採取すればよいですか
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A：唾液採取用スポンジの使用方法を参照してください。（参考データPDF）
- Q： 犬、牛、馬や他の動物から唾液はどうやって採取すればよいですか
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A：唾液採取用スポンジの使用方法を参照してください。（参考データPDF）
- Q：Orageneサンプルにはどのくらいの細菌由来のDNAが含まれていますか
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A：細菌16S rRNAプライマーを用いたリアルタイムPCRの測量によると細菌DNAは2～29%にわたり含まれており、中央値で6.8%含まれていました。それに比べマウスウォッシュでは細菌DNAが50%ほど、また綿棒による方法では約90%含まれています。Orageneに含まれる細菌DNA量は少ないので後程のアプリケーションへ影響しません。（参考データPDF）
- Q：Orageneを輸送する際、推奨する郵送方法はありますか
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A：推奨条件がありますので参照してください。（参考データPDF）
- Q：Oragene容器の底に黄色い物質が付着しています。これは何ですか
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A：唾液中のDNAを保存するために重要な物質です。取り除かないでください。
保存
精製
- Q：精製前のインキュベーションステップはいつ行えばよいですか
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A：唾液採取直後から精製直前の間の都合の良いときに行ってください。
- Q：インキュベーションステップでは何が起きていますか
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A：DNAを十分に抽出し、ヌクレアーゼを永久的に不活性化するために行います。
- Q： 精製溶液を加えるステップではどのようなことが起きていますか
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A：精製溶液が加えられるとタンパク質、ムチン、細胞片が沈殿し取り除かれます。
- Q：エタノールを加えるステップで起きていることは何ですか
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A：エタノールを加えることによりDNAが不溶性になり沈殿することにより溶液よりDNAを取り出します。
*Oragene精製プロトコルは基本的には通常の塩・エタノールによる沈殿方法を変更したものです。 - Q： 10分間氷上でインキュベートする時間は短縮することは可能ですか
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A：短縮することは可能ですが、10分間という時間はDNAの精製度を最高に保ちつつDNA採取量を最大限得るためにプロトコルを最適化し算出したものです。時間を短縮するということはこの標準を得ることが難しくなるかもしれません。
- Q：エタノールを加えるステップでエタノールを上清の2倍ではなく等量加えるのはなぜですか
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A：エタノールの量はDNA採取量を最大限得るためにプロトコルを最適化した結果です。等量以上にエタノールを加えると収量の減少につながります。
- Q：エタノールを加えた後、室温で10分間放置するステップをグリコーゲンを加えて簡略できませんか
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A：グリコーゲンを加え共沈殿させることは可能です。しかし最終精製DNAのなかにグリコーゲンが含まれてしまうので濁りのレベルが高まり260/280のレベルに影響してきてしまうかもしれません。しかし、この場合においても通常のPCRのような解析を行う場合であれば問題ありません。
- Q：最後の遠心分離の時間が2分では短くないですか
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A：遠心分離の時間が長いほど多いDNA収量が期待できるでしょう。しかし時間に対する収量の増加は微々たる物です。プロトコルの時間をできるだけ短縮化したかったので収量に影響のない2分という時間を設定しました。
- Q：得られたA260/280比率が低いのですが、向上させるためにはどうすれば良いですか
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A：Orageneエタノール沈殿プロトコルにより得られたDNAは1.6から1.9の範囲内のA260/280比率を得られるはずです。この比率よりも低い場合は、以下のトラブルシューティングに従ってください。(1)精製前にサンプルを50℃で最低1時間以上インキュベートしてください。(2)サンプルを精製する際、最初の遠心分離のステップの後タンパク質が含まれている沈殿物を取り込まないように注意してください。(3)使用している吸光度計がA260とA280の値からA320の値を自動的に差し引いていることを確認してください。（A320の値はサンプルの濁度を示しています。）そして(4)A260、A280の値がそれぞれ0.1から1.0の範囲内であることを確認してください。
- Q：付属している精製液の方法以外で精製することはできますか
- Q：自動抽出装置で精製することはできますか
- Q：精製したDNAを電気泳動にかけるとゲルの下の方に大きなしみができます。これは何ですか
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A：分子量の低いRNAです。
- Q：サンプルよりRNAを取り除くことはできますか
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A：可能です。参考データPDFを参照してください。
- Q：精製したDNAはどのように保存すればよいですか
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A：TEバッファーに溶解した状態で4℃で1-2ヶ月、長期的な保存は-20℃で凍結することを推奨します。（参考データPDF）
- Q： 唾液を採取してから精製まで最短でどのくらいの時間がかかりますか
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A：約100分です。
アプリケーション
- Q：どのアプリケーションでOrageneより得られたDNAが使用できますか
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A： PCR、リアルタイムPCR、multiplex PCR、SNPゲノタイピング、マイクロアレイ、シークエンシング、RFLPなどの使用に適しています。
- Q： Orageneより得られたDNAは全ゲノムアプリケーション (WGA) に使用できますか
- Q：Orageneサンプルに含まれる細菌DNAはアプリケーションに影響しますか
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A： Orageneに含まれる細菌DNA量は微量であり、またPCRベース技術の精度が高いため、血液由来のDNAと変わらないアプリケーション結果を得ることができます。（参考データPDF）
DNA採取キット Oragene®・DNA
TEL：044-853-2958（企画開発室）
FAX：044-854-1979（代）
株式会社 協同インターナショナル
〒216-0033
神奈川県川崎市宮前区宮崎2-10-9
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